Polymerasekettenreaktion

Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction = PCR) wurde 1987 von dem Biochemiker Kary B. Mullis entwickelt und erlaubte eine völlig neue Vorgehensweise bei der  Analyse von Genen. Mit diesem Verfahren ist es möglich, von bestimmten Nukleotid-sequen­zen in vitro millionenfach Kopien enzymatisch herzustellen. Erst durch die Vervielfältigung einer spezifischen DNA-Sequenz  in so großer Anzahl erhält man genügend Untersuchungs­material, um die speziellen DNA-Bereiche charakterisieren und mit geeigneten Methoden, wie z. B. der Gelelektrophorese, darstellen zu können. Als Ausgangsmaterial einer PCR reicht eine sehr geringe DNA-Menge (weniger als 1 Mikrogramm) aus, was einen frühzeitigen Nachweis von bakteriellen und viralen Infektionen ermöglicht. In der Dermatologie ist diese Methode auch im Bereich der Lymphomdiagnostik von großer Bedeutung.

Methode

Bei der PCR werden bestimmte Eigenschaften der natürlichen DNA-Replikation genutzt. Eine DNA-Polymerase synthetisiert einen neuen, komplementären DNA-Strang an einer einzel­strängigen Nukleinsäurematrize. Dazu werden Startermoleküle (primer) benötigt, die an die Matrizen-DNA hybridisieren. Durch die Wahl eines gegenläufig orientierten Oligonukleotid-Primerpaares kann die DNA-Sequenz zwischen den Primern gezielt vervielfältigt werden. Das entscheidende Prinzip der PCR ist die zyklische Wiederholung der einzelnen Reaktions­schritte, wodurch die Ausgangsmenge an DNA bis zu einem Faktor von etwa 10⁷ amplifiziert werden kann. Nach den Reaktionszyklen liegt das gewünschte Reaktionsprodukt in so großen Mengen vor, daß eine weitere Analyse durchgeführt werden kann.

Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR)

Mit Hilfe der RT-PCR können RNA-Sequenzen spezifisch amplifiziert werden. Besondere Bedeutung kommt dieser Methode zu, wenn seltene Transkripte nachgewiesen und analysiert werden sollen. Die RT-PCR beginnt mit der cDNA-Erststrangsynthese, wobei Gesamt-RNA oder mRNA als Matrize dienen kann. Das Produkt des ersten Reaktionsschrittes, ein DNA/RNA-Doppelstrang, wird anschließend in einer PCR als Matrize verwendet.

In unserer Klinik werden folgende Analysen routinemäßig durchgeführt:

Nachweis durch PCR

·        Humanes Papillomavirus (HPV)

·        Herpes simplex Virus (HSV 1, 2)

·        Cytomegalievirus (CMV)

·        Epstein-Barr Virus (EBV)

·        Borrelia burgdorferi

·        Rearrangementanalyse (CTCL)

Nachweis durch Reverse Transkriptase PCR

·        Tyrosinase/Melan-A

·        Hepatitis C Virus (HCV)

·        Human Immunodeficiency Virus

Der Nachweis von monoklonalen T-Zellen beim CTCL ist ein Beispiel der in unserer Klinik durchgeführten Untersuchungen mittels PCR.

Da die Mehrzahl der kutanen lymphoiden Infiltrate einen T-Zell-Immunphänotyp aufweisen und insbesondere initiale Formen der Mycosis fungoides diagnostische Probleme bereiten, ist die Klonalitätsanalyse des T-Zell-Rezeptors von großer Bedeutung.

Bei der Mycosis fungoides weisen die expandierten malignen T-Zellen ein monoklonales T-Zell-Rezeptor-Rearrangement auf, das mit Hilfe von vier unterschiedlichen PCRs untersucht wird. Um einen möglichst großen Bereich der g-Kette des T-Zell-Rezeptorgens abzudecken, werden die Primer der vier Hauptgruppen der variablen Regionen (Vg2, Vg9, Vg10 und Vg11) mit einem Primer-Mix bestehend aus vier Joining-Primern (Jg2, Jgp, Jgp1 und Jgp2) kombi­niert (K. Schuhmann et al., 1999).